PCR2:再用巢居引物TP3和TP4扩增出500bp片段,PCR1产物用蒸馏水稀释10倍,取5μ1用作第二次扩增.PCR2中MgCl2和引物浓度分别为5mmol/L和20μmol/L引物(TP3和TP4),其它条件与PCR1相同。
PCR产物分析。①取10μ1反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳；②Southern印迹后,用寡核苷酸探针TP5(以32P作末端标记)杂交。
3．扩增TpF1蛋白基因TyF1蛋白基因:100μ1反应物含:50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl2,0.2mg/ml明胶,1μmol/L dNTP,2mmol/L引物(F1和F2),2.5UTaqDNA聚合酶,10μ1经处理的兔睾丸梅毒螺旋体悬液,反应过程:94℃ 1min,55℃ 1.5min,72℃ 2.5min,循环40次，取10μ1PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳,Southern印迹后,用tpf-1特异的探针F3和tyf-1特异物的探针F4分别杂交。
为使扩增效率达到最大，反应参数应选择最佳数值。使用大片段双股DNA探针检测PCR产物，而不用合成的寡核苷酸探针,因为这样可通过标记得到较高、特异的放射活性。另外，大片段探针能最大减少野生株tpp47可变序列的假阴性结果及由于Taq DNA聚合酶的错误导致碱基替代的假阴性结果。实验证实：PCR的敏感性确能达到检测单一tpp47拷贝的水平。
由于临床标本可能含有大量人细胞和微生物，建立对梅毒螺旋体高度特异的PCR方法是很重要的。尽管大量数椐支持47Da膜抗原基因及其相应基因具梅毒螺旋体特异性，还应深入研究该方法的特异性。在EB染色的琼脂糖凝胶偶而可见非特异的PCR产物，（如扩增淋病奈氏球菌）时就需要用tpp47特异的探针杂交来增加特异性及敏感性。仅从梅毒螺旋体梅毒亚种和雅司亚种染色体DNA获得了特异的PCR产物，表明了病原性螺旋体非常相近的亲缘关系及47Da免疫蛋白高度保守的抗原性。扩增tpp47不能如常
